O grupo de Long Li na School of Life Sciences, Peking University publicou um artigo intitulado "Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex", publicado na Nature Structural & Molecular Biology. O estudo relata resultados estruturais e bioquímicos do supercomplexo TOM-TIM23 que medeia o transporte de proteínas nas mitocôndrias, revela uma nova via de importação de proteínas através do complexo TOM através da membrana externa mitocondrial e redefine a composição central do complexo transportador TIM23 na membrana mitocondrial interna.
Como uma das organelas mais importantes nas células eucarióticas, as mitocôndrias desempenham papéis importantes no fornecimento de energia, metabolismo intracelular, homeostase e apoptose. As mitocôndrias têm uma estrutura única de membrana lipídica de bicamada interna e externa, com mais de 1.000 proteínas distribuídas internamente. 99% das proteínas mitocondriais são codificadas por genes citosólicos, sintetizadas em ribossomos no citoplasma e transportadas através da membrana para as mitocôndrias para desempenhar suas funções. Portanto, o transporte de proteínas mitocondriais é crítico para manter e regular a atividade mitocondrial, e mutações em genes relacionados estão intimamente associadas ao desenvolvimento de muitas doenças metabólicas e cânceres em humanos. O grupo de Li Long tem trabalhado para explorar os mecanismos moleculares pelos quais as proteínas mitocondriais entram nas mitocôndrias, e o trabalho publicado inclui a resolução do caminho pelo qual as proteínas da membrana mitocondrial entram na membrana interna por meio do complexo de transporte TIM22 (Zhang Y. et al Cell Research 2021). O papel do supercomplexo TOM-TIM23 no transporte de proteínas mitocondriais é ainda mais importante neste estudo. Este supercomplexo, montado a partir de dezenas de subunidades de proteínas, abrange as membranas da bicamada mitocondrial interna e externa e controla o transporte de mais de 500 proteínas solúveis e de membrana mitocondriais. Nos últimos 40 anos, os pesquisadores estudaram extensiva e intensivamente as subunidades individuais dos complexos de transporte TOM e TIM23. No entanto, devido à natureza altamente dinâmica deste supercomplexo, a compreensão da questão central de como essas subunidades se reúnem para formar a via de transporte de proteínas ainda é muito limitada, especialmente para o complexo TIM23 na membrana endosomal, onde a composição da unidade de transporte central tem sido muito obscura.
Neste estudo, os autores começaram com a montagem de um supercomplexo TOM-TIM23 estável, exploraram vários esquemas de montagem e, finalmente, escolheram fundir a proteína fluorescente verde com a proteína mitocondrial como substrato de transporte e capturaram o estado intermediário do supercomplexo TOM-TIM23 para transportar substratos proteicos em células de levedura. Após a purificação in vitro, esse estado intermediário ainda pode ser estabilizado para estudos posteriores de biologia estrutural e bioquímica. Por meio da análise de partícula única desse estado intermediário por microscopia crioeletrônica, os autores descobriram que há uma interação direta entre o complexo TOM localizado na membrana externa e o complexo TIM23 localizado na membrana interna, ligando as membranas mitocondriais interna e externa, que entrega eficientemente o substrato proteico da membrana mitocondrial externa para a membrana interna (Fig. 1a). Em particular, o complexo TOM foi resolvido para uma resolução de 4,1 Å. A estrutura revelou uma "via de aminoácidos polares" dentro da parede interna da subunidade do canal Tom40, que é conservada entre espécies e media a passagem do substrato proteico através do poro intermediário Tom40 em uma forma desdobrada (Fig. 1b). Essa via é diferente das duas vias transmembrana em Tom40 propostas anteriormente com base em experimentos bioquímicos, demonstrando a versatilidade do complexo TOM em reconhecer e transportar eficientemente várias proteínas mitocondriais.
Fig. 1. Estrutura do supercomplexo TOM-TIM23. (a) Montagem esquemática e estrutura de microscopia crioeletrônica do supercomplexo TOM-TIM23. (b) Modelo estrutural de microscopia crioeletrônica do complexo TOM contendo o substrato proteico. (c) Modelo estrutural AlphaFold2 do heterotrímero Tim17-Tim23-Mgr2
Além disso, os autores introduziram sistematicamente aminoácidos não naturais em diferentes locais do substrato proteico e sondaram os arredores do substrato proteico na via de transporte de TOM-TIM23 usando foto-reticulação, identificando assim a subunidade central que ajuda diretamente o substrato a cruzar as duas membranas lipídicas. Os resultados experimentais mostraram que o fragmento C-terminal do substrato proteico pode fazer ligação cruzada com a subunidade Tom40 da membrana externa, um resultado consistente com observações estruturais. Surpreendentemente, no entanto, o fragmento N-terminal do substrato proteico faz ligação cruzada com as subunidades Tim17 e Mgr2 na membrana interna, mas não com a subunidade Tim23, que é comumente identificada como constituindo o canal de transporte da membrana interna. Este resultado sugere que pode haver um viés significativo na percepção da via de transporte central do complexo TIM23 em estudos anteriores. Para identificar ainda mais as subunidades e vias do transportador central no TIM23, os autores usaram uma combinação de modelagem AlphaFold2, reticulação bioquímica, genética de levedura e transporte in vitro de proteínas mitocondriais, e descobriram que o componente central do complexo TIM23 é um heterotrímero consistindo de subunidades Tim23, Tim17 e Mgr2, com Tim17 e Mgr2 face a face formando uma estrutura semelhante a um canal, enquanto Tim23 se liga a Tim17 em uma forma back-to-back e não está envolvido na formação do canal (Fig. 1c). Durante a translocação da proteína, o substrato proteico passa pela estrutura semelhante a um canal formada por Tim17 e Mgr2 e não entra em contato direto com a subunidade Tim23. Experimentos de mutagênese revelaram que o knockdown de Mgr2 na levedura não afetou a translocação de proteínas, sugerindo que apenas Tim17 é necessário na estrutura semelhante a um canal formada por Tim17 e Mgr2. A razão pela qual Tim17 pode ajudar proteínas a cruzar a membrana endosomal é devido à sua distribuição única de aminoácidos na superfície: por um lado, Tim17 tem uma região altamente conservada e carregada negativamente na entrada da membrana endosomal que pode romper a estrutura localizada da bicamada fosfolipídica e diminuir a barreira de energia para proteínas cruzarem a membrana lipídica; por outro lado, Tim17 tem uma região hidrofóbica conservada no centro da via, o que ajuda a manter a membrana interna da mitocôndria em uma condição hermética e a manter o potencial de membrana necessário para atividades fisiológicas mitocondriais. Tomando juntos os resultados de vários experimentos estruturais e bioquímicos, pode-se concluir que o complexo TIM23, com a subunidade Tim17 em seu núcleo, adota um modo misto para ajudar a translocação de proteínas, ou seja, Tim17 pode se ligar dinamicamente a outras subunidades para formar um canal para ajudar proteínas através da membrana, ou Tim17 trabalha no modo de trabalho da enzima de inserção para realizar a translocação de proteínas sozinha, sem a necessidade de formação de canal. Este resultado corrige a percepção equivocada no campo ao longo dos últimos 40 anos de que a subunidade Tim23 constitui um canal central.
Em resumo, este estudo desenvolveu uma nova estratégia para estudos de transporte de proteínas, revelou o caminho crítico para proteínas mitocondriais cruzarem a membrana lipídica da bicamada através do supercomplexo TOM-TIM23 (Figura 2), anulou o conhecimento de campo de longa data dos principais componentes do complexo de transporte TIM23 da membrana interna e descobriu um modo completamente novo de operação da enzima de transporte de proteínas, que estabelece uma base sólida para uma compreensão abrangente e aprofundada da biossíntese mitocondrial. síntese, estabelecendo uma base sólida para uma compreensão abrangente e aprofundada da biossíntese mitocondrial.
Figura 2. Via do transportador mitocondrial TOM-TIM23
Long Li é o autor correspondente do artigo, e Xueyin Zhou, um aluno de doutorado da turma de 2018 do Centro Conjunto de Ciências da Vida da Universidade de Pequim-Tsinghua, Yuqi Yang, um aluno de doutorado da turma de 2019 da Escola de Ciências da Vida, Dr. Peng Wang da plataforma de microscopia crioeletrônica da Universidade de Pequim, e Shanshan Wang, um aluno de doutorado da turma de 2020 da Escola de Ciências da Vida, são os co-primeiros autores. Dongjie Sun, um ex-técnico no laboratório de Li Long, Xiaomin Ou, um aluno de doutorado na Faculdade de Ciências da Vida, turma de 2022, e Yuke Lian, um aluno de doutorado na Faculdade de Ciências da Vida, turma de 2021, fizeram contribuições significativas para esta pesquisa. O Prof. Ning Gao e o Pesquisador Associado Ningning Li da Escola de Ciências da Vida, Universidade de Pequim, e o Pesquisador Xinzheng Zhang do Instituto de Biofísica, Academia Chinesa de Ciências, forneceram grande ajuda no cálculo de dados de microscopia crioeletrônica, e o Prof. Qing Li e o Prof. Gain Chang da Escola de Ciências da Vida, Universidade de Pequim, forneceram orientação importante sobre genética de levedura e experimentos de foto-reticulação, respectivamente. O trabalho de pesquisa foi apoiado pela plataforma de microscopia crioeletrônica da Universidade de Pequim, Centro de Computação de Alto Desempenho, Centro de Instrumentação da Escola de Ciências da Vida e Plataforma Nacional de Proteína Phoenix, e foi financiado pelo Laboratório Estadual de Biologia de Membrana, Centro Conjunto de Ciências da Vida da Universidade de Pequim-Tsinghua e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China.
